國(guó)家藥監(jiān)局器審中心關(guān)于發(fā)布運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則的通告（2022年第44號(hào)）

發(fā)布時(shí)間：2022-11-28

為進(jìn)一步指導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑的研發(fā)，規(guī)范審評(píng)工作，國(guó)家藥監(jiān)局器審中心組織制定了《運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》，現(xiàn)予發(fā)布。

特此通告。

附件：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則.doc

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局
醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心
2022年11月28日

附件

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑
注冊(cè)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)SMN1基因檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究和驗(yàn)證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于脊髓性肌萎縮癥（(spinal muscular atrophy，SMA)致病基因運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）第7或第7、第8外顯子拷貝數(shù)變異檢測(cè)相關(guān)試劑的注冊(cè)。預(yù)期用途限定為用于SMA的輔助診斷（遺傳診斷）或攜帶者檢測(cè)。本指導(dǎo)原則是基于qPCR建立，對(duì)于其他檢測(cè)技術(shù)（如MLPA、數(shù)字PCR、熔解曲線法、測(cè)序法及質(zhì)譜法等），可能部分要求不完全適用或本指導(dǎo)原則所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

SMA及相關(guān)基因的背景信息請(qǐng)見(jiàn)附件。

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ０凑铡扼w外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2. 申請(qǐng)人還需提交產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內(nèi)容。其中，需注意以下內(nèi)容：

1. 產(chǎn)品描述中應(yīng)詳述檢測(cè)原理、引物探針設(shè)計(jì)及其與檢測(cè)位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，選擇依據(jù)以及結(jié)果判斷等。拷貝數(shù)分析建議包括SMN1基因第7外顯子或第7、8外顯子，明確區(qū)分SMN1和SMN2的原理。

2. 與同類和/或前代產(chǎn)品的比較，應(yīng)著重從方法學(xué)、檢驗(yàn)原理、檢測(cè)的基因名稱、檢測(cè)靶點(diǎn)、變異類型以及臨床意義等方面詳細(xì)說(shuō)明申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別，并明確申報(bào)產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)與患者受益情況。

3. 預(yù)期用途需明確適用人群、樣本類型、基因名稱、檢測(cè)位點(diǎn)、變異類型及臨床用途。需提交SMA的發(fā)病原因、臨床癥狀、流行病學(xué)特征、該疾病相關(guān)診斷及有效治療方法，明確現(xiàn)有方法臨床應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)。提交SMA基因型分布的背景資料，明確基因名稱、基因組位置、基因轉(zhuǎn)錄本號(hào)。對(duì)于拷貝數(shù)變異，需明確檢測(cè)靶點(diǎn)、選擇依據(jù)及行業(yè)認(rèn)可證據(jù)，詳述變異信息、致病作用機(jī)制、遺傳模式、變異后果、變異檢出率以及境內(nèi)外人群數(shù)據(jù)等, 提交參考的數(shù)據(jù)庫(kù)及支持性文獻(xiàn)等。申請(qǐng)人需根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計(jì)及臨床研究合理聲稱適用人群及預(yù)期用途。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》。

（三）非臨床資料

1. 產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

1.1 產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（2022年第8號(hào)）的要求編寫指導(dǎo)原則。該類產(chǎn)品作為三類體外診斷試劑，應(yīng)將主要原材料及生產(chǎn)工藝要求等內(nèi)容作為附錄附于技術(shù)要求正文后。

如有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

1.2 產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》的要求，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)提供三個(gè)不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗(yàn)報(bào)告，有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的，應(yīng)當(dāng)使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)。報(bào)告形式可為申請(qǐng)人出具的自檢報(bào)告或委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的檢驗(yàn)報(bào)告。申請(qǐng)人開(kāi)展自檢的，應(yīng)當(dāng)符合《醫(yī)療器械注冊(cè)自檢管理規(guī)定》及相關(guān)法規(guī)的要求。

2. 分析性能研究

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性提交詳細(xì)的分析性能評(píng)估資料，包括試驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)樣本（需明確類型、來(lái)源、數(shù)量、處理方法、SMN1與SMN2拷貝數(shù)及其確定方法等）、可接受標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)論等，并需對(duì)SMN1和SMN2之間的相互影響進(jìn)行充分評(píng)估。分析性能評(píng)估的試驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則。

如試劑用于不同適用機(jī)型，需要在不同機(jī)型上分別進(jìn)行性能評(píng)估。

每項(xiàng)性能評(píng)估應(yīng)盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，并應(yīng)涵蓋正常人、攜帶者（如適用）及患者的不同樣本。

2.1樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性一般包括樣本各種實(shí)際運(yùn)輸及儲(chǔ)存（常溫、冷藏和冷凍）條件下的保存期限驗(yàn)證，以確認(rèn)樣本的保存條件及保存時(shí)間?？梢栽诤侠淼臏囟确秶鷥?nèi)，每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性?？衫鋬霰４娴臉颖具€應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行合理驗(yàn)證。

如核酸提取液可保存，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和保存時(shí)間進(jìn)行研究。

2.2 適用的樣本類型

如果試劑適用于多種樣本類型，應(yīng)采用合理方法對(duì)每種樣本類型及添加劑（如抗凝劑）進(jìn)行適用性的研究確認(rèn)。對(duì)于不同的樣本類型應(yīng)分別提交相應(yīng)的分析性能評(píng)估資料。

2.3核酸提取/純化性能

在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂崽崛?純化步驟。該步驟應(yīng)最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度、檢測(cè)限、精密度等進(jìn)行充分的驗(yàn)證，并評(píng)價(jià)該方法能否滿足該類產(chǎn)品的要求。不同樣本類型應(yīng)分別進(jìn)行核酸提取/純化性能的研究驗(yàn)證，并明確提取核酸的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 檢測(cè)準(zhǔn)確性

建議采用若干份臨床樣本驗(yàn)證該類產(chǎn)品的檢測(cè)準(zhǔn)確性，樣本類型與說(shuō)明書聲稱的樣本類型一致，樣本應(yīng)涵蓋所有可檢測(cè)的基因拷貝數(shù)，建議對(duì)低、中、高不同DNA濃度的樣本進(jìn)行研究。提供所有試驗(yàn)用樣本來(lái)源、型別及拷貝數(shù)確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

2.5精密度

SMN1精密度評(píng)價(jià)應(yīng)至少包含0拷貝、1拷貝及2拷貝SMN1基因的不同臨床樣本，試驗(yàn)操作完全按照說(shuō)明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等步驟。應(yīng)對(duì)每一反應(yīng)體系進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)。

精密度評(píng)價(jià)需滿足如下要求：

2.5.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要因素進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、檢測(cè)輪次和試劑批次等。

2.5.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以對(duì)室間重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.5.3用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本至少設(shè)置低濃度和中/高濃度水平。

2.5.4精密度指標(biāo)可設(shè)置為CV等（如有），申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。

2.6 檢測(cè)限

SMN1 拷貝數(shù)檢測(cè)的檢測(cè)限包括最高和最低檢測(cè)限。

最低檢測(cè)限可定義為在滿足一定的檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)基因不同拷貝數(shù)的最低人基因組DNA濃度。

最低檢測(cè)限的確立：可采用包含不同SMN1拷貝數(shù)的臨床樣本進(jìn)行研究，對(duì)于罕見(jiàn)型別可采用人源性細(xì)胞系。對(duì)人基因組DNA樣本梯度稀釋，對(duì)每個(gè)濃度水平重復(fù)檢測(cè)3～5次，可通過(guò)以100%可檢出的最低濃度作為估計(jì)檢測(cè)限，然后在此濃度附近制備若干濃度梯度樣本，每個(gè)濃度至少重復(fù)20次檢測(cè)，將具有95%檢出率水平濃度作為最低檢測(cè)限。

最低檢測(cè)限的驗(yàn)證：應(yīng)對(duì)試劑盒涵蓋的所有的檢測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行檢出能力的驗(yàn)證，至少包括含有0、1、2拷貝SMN1基因第7外顯子或第7、第8外顯子的臨床樣本。

同時(shí)，申請(qǐng)人亦應(yīng)評(píng)價(jià)產(chǎn)品可準(zhǔn)確檢出SMN1不同拷貝數(shù)的人基因組DNA濃度上限，即適當(dāng)檢出率水平下的最高人基因組DNA濃度，建議采用含有高拷貝SMN2基因的不同SMN1基因型樣本進(jìn)行最高檢測(cè)限的建立和確認(rèn)研究。樣本要求同最低檢測(cè)限評(píng)價(jià)要求。

應(yīng)提供所有試驗(yàn)用樣本來(lái)源、型別、樣本濃度及SMN1及SMN2拷貝數(shù)確定的方法等試驗(yàn)資料。

2.7分析特異性：

分析特異性受干擾和交叉反應(yīng)的影響。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)樣本中常見(jiàn)的干擾物質(zhì)和可能引起交叉反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行研究。

2.7.1交叉反應(yīng)：

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)微生物（如適用）、核酸序列相近或具有同源性、以及其他易引起交叉反應(yīng)的變異類型序列進(jìn)行交叉反應(yīng)研究。申請(qǐng)人應(yīng)說(shuō)明交叉反應(yīng)樣本的來(lái)源、制備方法、基因拷貝數(shù)確認(rèn)方法，提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。同時(shí)申請(qǐng)人還應(yīng)驗(yàn)證檢測(cè)靶序列范圍內(nèi)常見(jiàn)突變位點(diǎn)的交叉干擾。

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)SMN2對(duì)SMN1交叉干擾進(jìn)行研究。應(yīng)對(duì)不同SMN1：SMN2的拷貝數(shù)組合進(jìn)行充分驗(yàn)證。如含有高拷貝SMN2（4～5拷貝）的高濃度樣本對(duì)SMN1的不同拷貝數(shù)產(chǎn)生的交叉干擾反應(yīng)（應(yīng)包括第7外顯子或第7、第8外顯子）。

申請(qǐng)人應(yīng)提交交叉反應(yīng)序列的選擇依據(jù)，說(shuō)明交叉反應(yīng)樣本的來(lái)源/制備方法、核酸序列確認(rèn)方法，提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2.7.2應(yīng)針對(duì)可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白，外源干擾物主要包括適用人群血液樣本采集可能用到的抗凝劑、常用藥物及其他可能引入的干擾物質(zhì)等。針對(duì)不同樣本類型，建議分別進(jìn)行相應(yīng)的干擾研究。

干擾試驗(yàn)可通過(guò)在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評(píng)價(jià)干擾物質(zhì)對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進(jìn)行干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)；如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

2.8對(duì)于采用2-ΔΔCt法的試劑，需提交目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致性研究資料。

3. 穩(wěn)定性研究資料

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、使用穩(wěn)定性（如開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性（如適用）、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）等）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)限制（如適用）研究等。申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。

實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究應(yīng)采用至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后，選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)品性能評(píng)價(jià)，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

4. 陽(yáng)性判斷值或參考區(qū)間研究資料

建議申請(qǐng)人納入一定數(shù)量的臨床樣本，結(jié)合產(chǎn)品特性可采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法對(duì)產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)/臨界值進(jìn)行研究確認(rèn)。樣本應(yīng)包括來(lái)自正常人、攜帶者及患者不同拷貝數(shù)的各種基因型（如至少應(yīng)包含0、1、2拷貝數(shù)SMN1基因的樣本），申請(qǐng)人應(yīng)詳細(xì)闡述所采用方法的選擇依據(jù)（如權(quán)威文獻(xiàn)、行業(yè)共識(shí)等），并詳細(xì)闡述計(jì)算公式和各參數(shù)代表的意義。

應(yīng)提交詳細(xì)研究方案，試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程。明確所用樣本類型、樣本來(lái)源、樣本量估算的方法、樣本例數(shù)、臨床背景信息、基因型及拷貝數(shù)確認(rèn)過(guò)程及數(shù)據(jù)等信息。

如試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說(shuō)明灰區(qū)范圍的確定方法?；覅^(qū)的設(shè)定應(yīng)提交理論和實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果的依據(jù)，并在說(shuō)明書【陽(yáng)性判斷值】和【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】項(xiàng)進(jìn)行解釋說(shuō)明。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應(yīng)成分、對(duì)照品/質(zhì)控品及企業(yè)參考品的研究資料。

5.1.1此類產(chǎn)品的主要反應(yīng)成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測(cè)所需引物、探針、酶、dNTPs等。申請(qǐng)人應(yīng)提交相關(guān)原材料的來(lái)源、選擇、制備方法的研究資料，質(zhì)量分析證書，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和檢驗(yàn)資料。如為申請(qǐng)人自制，應(yīng)提交詳細(xì)的工藝穩(wěn)定性研究資料；如為外購(gòu)，還應(yīng)提交供應(yīng)商篩選資料以及供應(yīng)商提供的原材料質(zhì)量檢定報(bào)告。如適用，提交企業(yè)參考品的研究資料，包括來(lái)源、組成、陰陽(yáng)性和/或量值確認(rèn)等。

5.1.1.1核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。如產(chǎn)品不包含提取試劑，則需明確配套的核酸提取/純化試劑并提交相應(yīng)的提取效率驗(yàn)證資料。

5.1.1.2引物、探針

申請(qǐng)人應(yīng)詳述SMN1及內(nèi)控基因（如適用）引物探針的設(shè)計(jì)原則、靶基因座位選擇、靶基因信息（基因名稱、參考序列號(hào)），同時(shí)應(yīng)提供引物探針核酸序列、模板核酸序列及兩者對(duì)應(yīng)關(guān)系。建議設(shè)計(jì)多套引物探針以供篩選，針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的準(zhǔn)確性、特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最佳設(shè)計(jì)，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)選定的引物探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，一般包括：序列準(zhǔn)確度、純度（HPLC純等）、濃度、探針熒光標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)（如適用），以及功能性試驗(yàn)等，并依據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

由于SMN1和SMN2高度同源，只有5個(gè)堿基不同，應(yīng)從產(chǎn)品設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)角度詳述如何避免SMN1和SMN2的相互影響。

5.1.1.3酶

酶包括DNA聚合酶和/或尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)各種酶的活性進(jìn)行驗(yàn)證，提交功能性試驗(yàn)資料，并確定酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。如有降低Taq酶非特異性擴(kuò)增的措施，需詳細(xì)描述（例如采用熱啟動(dòng)酶，Taq抗體等）。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具有5’-3’外切酶活性（如適用），具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

5.1.1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度等的驗(yàn)證資料，以及功能性試驗(yàn)資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.2對(duì)照品/質(zhì)控品

試劑盒應(yīng)根據(jù)檢測(cè)原理設(shè)置各種對(duì)照品（質(zhì)控品）、質(zhì)控探針（如適用）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品整個(gè)反應(yīng)體系的有效監(jiān)控。通常至少包括含有0拷貝、1拷貝及2拷貝SMN1第7外顯子或第7、8外顯子的對(duì)照品和空白對(duì)照?？瞻讓?duì)照為不含靶核酸的溶液。

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，明確所采取的具體措施（如設(shè)置內(nèi)標(biāo)等）、選擇依據(jù)，并提交相應(yīng)研究資料。

對(duì)照品可采用人基因組DNA、細(xì)胞系提取的基因組DNA或質(zhì)粒等。對(duì)照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請(qǐng)人應(yīng)提供對(duì)照品原料選擇、制備、基因序列確認(rèn)、拷貝數(shù)及濃度確定過(guò)程、內(nèi)參基因與靶基因的比例確定等的詳細(xì)研究數(shù)據(jù)，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求。

產(chǎn)品如涉及用于拷貝數(shù)計(jì)算的內(nèi)控基因及對(duì)照品, 需提供內(nèi)控基因的選擇依據(jù)、內(nèi)控基因與靶標(biāo)之間的相互影響、對(duì)照品的選擇依據(jù)、原料來(lái)源、制備過(guò)程、基因拷貝數(shù)確認(rèn)及DNA濃度確定等的詳細(xì)研究資料，并提交質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立資料，建議采用臨床樣本或細(xì)胞系或其提取的基因組DNA。

5.1.3企業(yè)參考品

SMN1拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑的企業(yè)參考品主要包括SMN1純合缺失參考品、SMN1單拷貝參考品、SMN1多拷貝參考品、特異性參考品、檢測(cè)限參考品和精密度參考品等，可根據(jù)預(yù)期用途的不同，將相應(yīng)拷貝數(shù)參考品設(shè)置為陽(yáng)性參考品或陰性參考品。設(shè)置參考品時(shí)應(yīng)充分考慮SMN1和SMN2之間的相互影響，并至少明確SMN1和SMN2（如適用）拷貝數(shù)。申請(qǐng)人應(yīng)提交企業(yè)參考品的具體組成、原料來(lái)源、選擇、制備方法、基因拷貝數(shù)確認(rèn)、DNA濃度確認(rèn)以及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)研究資料等。建議采用臨床樣本、臨床樣本提取的基因組DNA或細(xì)胞系制備，樣本應(yīng)明確其來(lái)源及型別確認(rèn)資料。若采用細(xì)胞系，如為自制，需提交詳細(xì)的細(xì)胞系構(gòu)建資料及確認(rèn)資料；如為外購(gòu)，應(yīng)提供外購(gòu)商名稱、細(xì)胞系名稱、細(xì)胞類型、基因型信息及確認(rèn)資料，并提供外購(gòu)商提供的質(zhì)檢報(bào)告。

5.1.3.1 SMN1純合缺失參考品：應(yīng)至少包括0拷貝SMN1第7外顯子以及0拷貝SMN1第8外顯子（如包含第8外顯子檢測(cè)）的純合缺失型樣本。

5.1.3.2 SMN1單拷貝參考品：主要包括含1拷貝SMN1第7外顯子的雜合缺失型樣本，或含1拷貝第7、第8外顯子（如適用）的雜合缺失型樣本。

5.1.3.3 SMN1多拷貝參考品：應(yīng)包括含2拷貝及大于2拷貝（如適用）的SMN1第7外顯子或第7、第8外顯子樣本。

5.1.3.4特異性參考品：建議包括高濃度SMN2不同拷貝數(shù)樣本及易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的同源序列樣本。同時(shí)應(yīng)盡量包含檢測(cè)范圍外其他檢測(cè)位點(diǎn)的樣本等。其中SMN2不同拷貝數(shù)樣本應(yīng)包括不同的SMN1：SMN2拷貝數(shù)比例，SMN1拷貝數(shù)應(yīng)包括產(chǎn)品可檢測(cè)的拷貝數(shù)范圍，至少包括0拷貝、1拷貝、2拷貝，SMN2基因至少包括4-5拷貝。如涉及納入檢測(cè)范圍外其他罕見(jiàn)型別，也可采用質(zhì)粒。

5.1.3.5 檢測(cè)限參考品：濃度水平可選擇最低檢測(cè)限附近水平，應(yīng)至少包含可檢測(cè)的SMN1第7外顯子或第7、第8外顯子拷貝數(shù)范圍，至少包括0、1、2拷貝。

5.1.3.6精密度參考品應(yīng)至少包括SMN1拷貝數(shù)為單拷貝（[1+0]）和多拷貝(大于等于2拷貝）的低濃度臨床樣本、臨床樣本提取的人基因組DNA或細(xì)胞系。

如有適用于SMN1或SMN2拷貝數(shù)檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，企業(yè)參考品的要求應(yīng)不低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。

5.2 主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記（如有）等工藝過(guò)程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)對(duì)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

反應(yīng)體系研究指反應(yīng)條件的選擇確定過(guò)程，包括分析前樣本類型的選擇、樣本采集、預(yù)處理（如有）、樣本用量、試劑用量、PCR反應(yīng)體系及檢測(cè)過(guò)程中的反應(yīng)條件/參數(shù)、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）等的確定，并需明確樣本所需達(dá)到的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及確定過(guò)程。如產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行的研究資料。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如有差異應(yīng)分別提交。

（四）臨床評(píng)價(jià)資料

該類試劑應(yīng)通過(guò)臨床試驗(yàn)路徑進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。臨床試驗(yàn)應(yīng)滿足《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類產(chǎn)品臨床試驗(yàn)中應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

1.針對(duì)“脊髓性肌萎縮癥輔助診斷”預(yù)期用途

基于目前的產(chǎn)品申報(bào)現(xiàn)狀，該預(yù)期用途用于檢測(cè)SMN1基因的拷貝數(shù)變異，應(yīng)至少包括第7外顯子的拷貝數(shù)變異，但不包括該基因點(diǎn)突變等其他變異。

1.1臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員

申辦者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

1.2臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

該預(yù)期用途的適用人群一般包括：具有相關(guān)癥狀和/或體征的疑似脊髓性肌萎縮癥患者；需與脊髓性肌萎縮癥進(jìn)行鑒別診斷的其他疾病患者（如：先天性肌病、先天性及各類肌營(yíng)養(yǎng)不良、代謝性肌病、重癥肌無(wú)力、先天性肌無(wú)力綜合征、周圍神經(jīng)病或Prader-willi綜合征等）。

臨床樣本一般為抗凝外周全血樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)分別滿足申報(bào)產(chǎn)品說(shuō)明書、對(duì)比方法/對(duì)比試劑說(shuō)明書及第三方試劑說(shuō)明書（如有）的相關(guān)要求。

1.3臨床試驗(yàn)對(duì)比方法

如已有同類產(chǎn)品上市，原則上應(yīng)選擇已上市同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，對(duì)比試劑應(yīng)涵蓋申報(bào)產(chǎn)品的檢測(cè)范圍。

1.4最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法估算樣本量，詳細(xì)描述所使用統(tǒng)計(jì)方法及各參數(shù)的確定依據(jù)。

針對(duì)試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)性能的驗(yàn)證，建議采用單組目標(biāo)值法分別估算每個(gè)外顯子的最低樣本量，通過(guò)陽(yáng)性符合率或陰性符合率分別估算陽(yáng)性和陰性樣本的例數(shù)，同時(shí)考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽(yáng)性符合率和陰性符合率的目標(biāo)值（臨床可接受的最低標(biāo)準(zhǔn)）均不低于95%。其中，陽(yáng)性樣本包括拷貝數(shù)為1（雜合型）和0（純合缺失型）的樣本，陰性樣本包括拷貝數(shù)為2（野生純合型）的樣本。綜合考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求、臨床流行率及申報(bào)產(chǎn)品的技術(shù)特點(diǎn)，建議每個(gè)外顯子的0拷貝（純合缺失型）樣本應(yīng)不少于100例。

2.針對(duì)“攜帶者檢測(cè)”預(yù)期用途

基于目前的產(chǎn)品申報(bào)現(xiàn)狀，該預(yù)期用途用于SMN1基因的拷貝數(shù)變異，應(yīng)至少包括第7外顯子的拷貝數(shù)變異，但不包括該基因其他點(diǎn)突變等微小變異，且不包括SMN2基因。該預(yù)期用途的應(yīng)用應(yīng)符合國(guó)家及地方衛(wèi)生管理部門的相關(guān)規(guī)定。

2.1臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和人員

申辦者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

建議選擇不同地區(qū)的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開(kāi)展臨床試驗(yàn)，且臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有相關(guān)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。臨床試驗(yàn)操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)相應(yīng)的培訓(xùn)，并能熟練操作試驗(yàn)。機(jī)構(gòu)和人員應(yīng)遵循《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》及其他相關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

2.2臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

該預(yù)期用途的適用人群為孕前或孕早期人群。

臨床樣本一般為抗凝外周血樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)符合國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等相關(guān)文件的規(guī)定，并滿足相關(guān)產(chǎn)品說(shuō)明書的要求。

2.3最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

應(yīng)根據(jù)臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，同時(shí)結(jié)合適用人群的攜帶率進(jìn)行樣本量估算，并在臨床試驗(yàn)方案中明確最低樣本量確定的依據(jù)。建議采用單組目標(biāo)值法分別估算每個(gè)外顯子的最低樣本量，通過(guò)陽(yáng)性符合率估算陽(yáng)性樣本的例數(shù)，同時(shí)結(jié)合攜帶率，并考慮脫落情況，估算最低樣本總量。估算樣本量時(shí)，陽(yáng)性符合率的目標(biāo)值（臨床可接受的最低標(biāo)準(zhǔn)）不低于95%。

為評(píng)估試驗(yàn)體外診斷試劑的臨床意義和臨床價(jià)值，臨床試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行前瞻性研究，并通過(guò)前瞻性研究檢出一定數(shù)量的夫妻雙方均為攜帶者的病例。

進(jìn)行結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，陰性符合率的點(diǎn)估計(jì)值應(yīng)不低于97%。

2.4臨床試驗(yàn)方法

建議采用臨床公認(rèn)的方法（如：MLPA方法等）或已上市同類產(chǎn)品作為對(duì)比方法/對(duì)比試劑，評(píng)價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑的臨床性能。如選擇臨床公認(rèn)的方法作為對(duì)比方法，應(yīng)對(duì)該方法進(jìn)行嚴(yán)格的性能確認(rèn)，并應(yīng)嚴(yán)格按照建立的方法及相關(guān)規(guī)定等進(jìn)行臨床試驗(yàn)及質(zhì)量控制。

3.如有其他預(yù)期用途，應(yīng)設(shè)計(jì)科學(xué)的臨床試驗(yàn)，提供充分的證據(jù)，證明其預(yù)期用途。

4.不同預(yù)期用途的通用要求

4.1臨床試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析

4.1.1應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案、小結(jié)和報(bào)告中明確試驗(yàn)體外診斷試劑、對(duì)比方法/對(duì)比試劑和第三方試劑（如有）的試驗(yàn)方法。

4.1.2 臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表應(yīng)以列表方式表示，包括試驗(yàn)體外診斷試劑的結(jié)果、對(duì)比方法/對(duì)比試劑的結(jié)果、第三方試劑的檢測(cè)結(jié)果（如有）、臨床診斷背景信息、年齡和性別等。其中，臨床診斷背景信息為脊髓性肌萎縮癥的病例應(yīng)明確其實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)，如：復(fù)合雜合突變的檢測(cè)結(jié)果等。

4.1.3以交叉表分別總結(jié)兩種方法/試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以驗(yàn)證兩種方法/試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)體外診斷試劑與臨床診斷進(jìn)行比對(duì)時(shí)的臨床靈敏度和臨床特異度。

4.1.4 結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種方法/試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用合理方法進(jìn)行復(fù)核，并結(jié)合臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果等對(duì)差異原因進(jìn)行充分分析。

4.2臨床試驗(yàn)方案

各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由該實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申辦者的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程。

試驗(yàn)方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程和結(jié)果判定時(shí)，應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比方法/對(duì)比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，試驗(yàn)體外診斷試劑的樣本類型不應(yīng)超越對(duì)比方法/對(duì)比試劑對(duì)樣本類型的要求。

4.3臨床試驗(yàn)小結(jié)和報(bào)告

應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書

產(chǎn)品說(shuō)明書是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求（按照現(xiàn)行版本執(zhí)行）。產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明參考文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

下面對(duì)SMN1基因拷貝數(shù)檢測(cè)類產(chǎn)品說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于檢測(cè)人xx樣本基因組DNA中的SMN1xxx位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異，用于xxxx用途。其中xx需明確適用的樣本類型，xxx需明確檢測(cè)的位點(diǎn)，xxxx根據(jù)支持的臨床證據(jù)可包括SMA的輔助診斷（遺傳診斷）和攜帶者檢測(cè)。

1.2介紹SMA相關(guān)的臨床背景信息及實(shí)驗(yàn)室診斷方法等，介紹被測(cè)靶標(biāo)的相關(guān)情況。

2. 【檢驗(yàn)原理】

2.1對(duì)試劑盒的被測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)描述（基因組位置、基因的轉(zhuǎn)錄本號(hào)，外顯子7及8的相關(guān)特征等），對(duì)試劑盒所用探針、引物或拷貝數(shù)的判定等進(jìn)行詳細(xì)介紹；對(duì)不同樣本反應(yīng)管組合、內(nèi)參基因設(shè)置、對(duì)照品（質(zhì)控品）設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行介紹。

2.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行適當(dāng)介紹。對(duì)區(qū)分SMN2的原理進(jìn)行詳細(xì)描述。如需通過(guò)計(jì)算對(duì)SMN1的拷貝數(shù)進(jìn)行判斷，應(yīng)詳述計(jì)算原理及公式。

3. 【主要組成成分】

3.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱或數(shù)量等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必需的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱及其他相關(guān)信息。

3.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱和醫(yī)療器械備案號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期等信息。

5.【適用儀器】

明確經(jīng)驗(yàn)證的所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6. 【樣本要求】

詳述樣本類型的選擇與樣本處理的要求。樣本的采集、處理、運(yùn)送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說(shuō)明試驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1試驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、試驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。

7.2試劑配制方法和注意事項(xiàng)。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用），對(duì)核酸提取純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)控，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.6 熔解曲線（如適用）: 各階段溫度、時(shí)間設(shè)置，升溫速度。

7.7 儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)樣本及其他對(duì)照品的熒光通道選擇等。

8.【參考區(qū)間或陽(yáng)性判斷值】

簡(jiǎn)要概述參考區(qū)間或陽(yáng)性判斷值具體判斷標(biāo)準(zhǔn)及研究驗(yàn)證情況。需對(duì)不同SMN1拷貝數(shù)的參考區(qū)間或陽(yáng)性判斷值分別進(jìn)行描述。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合對(duì)照品、樣本管、參比樣本檢測(cè)結(jié)果以及檢測(cè)類型，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

需明確不同的結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步采取何種措施，何種情況需進(jìn)行遺傳咨詢。

僅為生殖腺嵌合體的攜帶者，采用血液細(xì)胞檢測(cè)可能為陰性結(jié)果。

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】

10.1對(duì)產(chǎn)品可檢出及不能檢出的變異類型進(jìn)行說(shuō)明。

10.2 產(chǎn)品僅對(duì)下述檢測(cè)類型xx進(jìn)行了驗(yàn)證。

10.3有關(guān)假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析。

10.3.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理或核酸過(guò)度降解均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

10.3.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

10.3.3高拷貝SMN2與SMN1之間相互的影響。

10.3.4 SMN1微小突變無(wú)法檢出可能導(dǎo)致的假陰性。

10.3.5 由于引物探針結(jié)合位置發(fā)生的多態(tài)性或點(diǎn)突變而可能導(dǎo)致的假陽(yáng)性。

10.3.6 其他可能引起假陽(yáng)性或假陰性的情形。

10.4對(duì)[2+0]基因型、微小突變及SMN1缺失的低比例嵌合體、檢測(cè)范圍外的其他外顯子拷貝數(shù)變異、SMN1-SMN2融合基因等檢出能力的局限性進(jìn)行說(shuō)明（如不能檢出）。

10.5有癥狀患者的雜合缺失需要進(jìn)一步采取合適的方法確認(rèn)。

10.6本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不能單獨(dú)作為確診或排除病例的依據(jù)，為達(dá)到診斷目的，此檢測(cè)結(jié)果要與臨床檢查、病史、連鎖遺傳分析及其他的檢查結(jié)果綜合使用。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：

11.1對(duì)相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）檢測(cè)的符合情況。

11.2 準(zhǔn)確性：簡(jiǎn)述研究用樣本、試驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)結(jié)果。

11.3 最低檢測(cè)限：簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法，并明確最低檢測(cè)限結(jié)果。

11.4精密度：簡(jiǎn)單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

11.5 檢測(cè)范圍：明確可準(zhǔn)確、特異檢測(cè)SMN1基因拷貝數(shù)變異的人基因組DNA濃度范圍。

11.6分析特異性：

11.6.1交叉反應(yīng)驗(yàn)證：交叉反應(yīng)驗(yàn)證情況（包括SMN2基因及其他易產(chǎn)生交叉反應(yīng)序列的交叉反應(yīng)等）。

11.6.2干擾物質(zhì)驗(yàn)證：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

11.7 臨床試驗(yàn)：簡(jiǎn)要介紹臨床試驗(yàn)樣本、試驗(yàn)方法、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

12.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

12.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》現(xiàn)行有效版本等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3攜帶者檢測(cè)前后應(yīng)進(jìn)行遺傳咨詢，強(qiáng)調(diào)殘余風(fēng)險(xiǎn)。無(wú)論其外周血基因檢測(cè)結(jié)果是否提示為攜帶者，再次生育時(shí)均應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

三、參考文獻(xiàn)

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背景信息

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是一組以脊髓前角ɑ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性導(dǎo)致的肌無(wú)力和肌萎縮為主要臨床特征的遺傳性神經(jīng)肌肉病，是兒童最常見(jiàn)的神經(jīng)肌肉病。SMA最常見(jiàn)的形式是由定位于5q13.2的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（motor neuron survival gene1，SMN1，OMIM # 600354）致病性變異所導(dǎo)致的5q-SMA，約占所有SMA病例的95%，呈常染色體隱性遺傳。SMA患者臨床表現(xiàn)差異大，從出生前到成人期均可發(fā)病，發(fā)病率約為1/10000-1/6000，攜帶率為1/50-1/40，具有種族差異性。SMA已被列入國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)、科學(xué)技術(shù)部、工業(yè)和信息化部、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局、國(guó)家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合公布的《第一批罕見(jiàn)病目錄》中。

人基因組有兩個(gè)高度同源的SMN基因（同源性>99.9%），位于5q13.2端粒側(cè)的SMN1（NG_008691.1）基因和著絲粒側(cè)的SMN2，兩者僅存在5個(gè)堿基差異，其中位于第7外顯子第6位c.840的C/T（SMN1為c.840 C，SMN2為c.840 T）導(dǎo)致90%的SMN2 mRNA第7外顯子被選擇性剪接，僅有10%的SMN2表達(dá)全長(zhǎng)有功能的SMN蛋白。SMN1決定疾病的發(fā)生，而SMN2影響疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)展。

SMN1基因編碼的全長(zhǎng)SMN蛋白在各組織細(xì)胞廣泛表達(dá)，SMN1基因的致病性突變可引起SMN蛋白表達(dá)水平下降或功能喪失。在表型正常（包括正常人和攜帶者）的人群中，SMN1基因拷貝數(shù)常為1~4個(gè)，正常人基因型包括常見(jiàn)的[1+1]型及罕見(jiàn)的[2+1]型和[2+2]型；攜帶者其中一條染色體含1或2拷貝功能正常的SMN1基因，另一條染色體含缺失或微小變異的功能異常SMN1基因，基因型可為雜合缺失 （[1+0]型、[2+0]型）或雜合突變（[1+1d]和[2+1d]型） （d代表SMN1基因內(nèi)含有微小變異而功能異常，如無(wú)義突變、移碼突變、錯(cuò)義突變等）。

在表型異常的SMA患者中，突變基因型主要有兩類，95%由SMN1雙等位基因純合缺失（[0+0]基因型）所致；5%由SMN1復(fù)合雜合突變（[0+1d]基因型）所致，SMN1雙等位基因均為微小變異（[1d+1d]）的情況則非常罕見(jiàn)。SMN1缺失大部分為外顯子7合并外顯子8共同缺失，少部分僅為外顯子7缺失。

SMN2全長(zhǎng)mRNA編碼與SMN1相同的SMN蛋白。SMN2的拷貝數(shù)從0到多個(gè)不等。SMN2拷貝數(shù)是目前公認(rèn)的SMA修飾因子，患者攜帶SMN2拷貝數(shù)越多表型越輕，但其與表型的相關(guān)性不完全一致，SMN2的序列變異及其他基因也可能影響SMA的表型。因此，SMN2的拷貝數(shù)結(jié)果只能對(duì)SMA患病兒童或胎兒的臨床嚴(yán)重程度提供一種可能性的參考信息而非確定性結(jié)論。此外對(duì)非患者人群不需要進(jìn)行SMN2的拷貝數(shù)檢測(cè)。

臨床疑診為SMA的患者，可選擇基因檢測(cè)、血清肌酸激酶（CK）、肌電圖檢查、肌肉病理進(jìn)行輔助檢查以明確診斷。其中SMN1拷貝數(shù)和致病性變異的檢測(cè)結(jié)果用于疾病診斷或排除診斷，若SMN1基因第7外顯子或第7、8外顯子純合缺失，即可診斷為SMN1純合缺失型患者。對(duì)于非純合缺失變異，還需對(duì)SMN1的致病性微小變異進(jìn)行分析確認(rèn)。

SMA攜帶者檢測(cè)的靶標(biāo)至少包括SMN1第7外顯子，當(dāng)SMN1第7外顯子為1個(gè)拷貝數(shù)時(shí)，即為SMA攜帶者。SMN2不在攜帶者檢測(cè)范圍。

綜上所述，考慮到目前國(guó)內(nèi)注冊(cè)申報(bào)的產(chǎn)品均為SMN1檢測(cè)試劑，本指導(dǎo)原則僅對(duì)SMN1基因檢測(cè)試劑的申報(bào)要求進(jìn)行闡述?；谀壳皩?duì)于SMN1檢測(cè)試劑的認(rèn)知，本指導(dǎo)原則闡述的SMN1檢測(cè)的預(yù)期用途限定為：用于體外檢測(cè)人外周血樣本人基因組DNA中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）第7或第7、第8外顯子拷貝數(shù)變異，用于SMA的輔助診斷（遺傳診斷）或攜帶者檢測(cè)。如申報(bào)其他預(yù)期用途，申請(qǐng)人可根據(jù)產(chǎn)品具體特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，適用部分可參考本指導(dǎo)原則。

常用的SMN1基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法包括多重連接探針擴(kuò)增（MLPA），定量聚合酶鏈反應(yīng)法（qPCR）等。MLPA與qPCR方法均不能檢測(cè)SMN1微小變異及[2+0]基因型。本指導(dǎo)原則是基于qPCR建立，對(duì)于其他檢測(cè)技術(shù)（如MLPA、數(shù)字PCR、熔解曲線法、測(cè)序法及質(zhì)譜法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。