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HLA-B27基因檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（征求意見稿）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對人類白細(xì)胞抗原B27（HLA-B27）基因檢測試劑注冊申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對HLA-B27基因檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則為注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

強(qiáng)直性脊柱炎是一種慢性炎性疾病，本病常發(fā)于青壯年男性，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織和外周關(guān)節(jié)，可伴發(fā)前葡萄膜炎等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，嚴(yán)重者發(fā)生脊柱畸形和強(qiáng)直。

HLA-B27基因位于人類第6號染色體短臂HLA基因B座，具有高度基因多態(tài)性，其表達(dá)產(chǎn)物為HLA-B27抗原。HLA-B27 抗原表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎高度相關(guān)，超過90%的強(qiáng)直性脊柱炎患者的HLA?B27 抗原表達(dá)為陽性，而普通人群中僅5% ~10% 為陽性。HLA-B27在其他脊柱關(guān)節(jié)炎疾病中也有不同的檢出，在反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎中陽性率可達(dá)60%-90%，在銀屑病關(guān)節(jié)炎和炎性腸病關(guān)節(jié)炎中陽性率均可達(dá)50%-60%。

HLA-B27約有167個(gè)基因亞型，各亞型分布存在地域和人種差異。HLA-B*2705是全球分布最廣的亞型，被認(rèn)為是其他基因亞型的祖基因。在中國漢族人群中，HLA-B*2704和HLA-B*2705是主要優(yōu)勢亞型，同時(shí)還存在HLA-B*2702、HLA-B*2703、HLA-B*2706、HLA-B*2707、HLA-B*2709。HLA-B*2702、HLA-B*2704、HLA-B*2705和HLA-B*2707是疾病易感基因，而HLA-B*2703、HLA-B*2706和HLA-B*2709與疾病的關(guān)系尚存在爭議。

本指導(dǎo)原則適用于基于熒光PCR法，定性檢測人靜脈全血樣本中的HLA-B27基因的試劑，用于強(qiáng)直性脊柱炎的輔助診斷。

對于采用其他分子生物學(xué)檢測方法（如基因測序法）或其他樣本類型的檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面；申請人可參考本指導(dǎo)原則，同時(shí)依據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進(jìn)行評價(jià)，對不適用部分闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則針對相關(guān)產(chǎn)品注冊申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，同時(shí)建議申請人參考已上市同類產(chǎn)品的產(chǎn)品名稱。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表（應(yīng)包含醫(yī)療器械唯一標(biāo)識）、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。其中,產(chǎn)品描述應(yīng)詳述技術(shù)原理、產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價(jià)、與同類和/或前代產(chǎn)品的比較等。與同類和/或前代產(chǎn)品的比較應(yīng)著重從預(yù)期用途、技術(shù)原理、主要組成成分、性能指標(biāo)、臨床應(yīng)用情況等方面詳細(xì)說明申報(bào)產(chǎn)品與已獲批準(zhǔn)的同類/前代產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價(jià)等結(jié)果，依據(jù)相關(guān)文件資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

第三類體外診斷試劑應(yīng)當(dāng)提供三個(gè)不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗(yàn)報(bào)告。目前已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)布，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求?？商峤灰韵氯我恍问降臋z驗(yàn)報(bào)告：

（1）申請人出具的自檢報(bào)告。

（2）委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的檢驗(yàn)報(bào)告。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應(yīng)提交在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行的所有分析性能評估資料，包括具體試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果及結(jié)論等詳細(xì)資料。有關(guān)試驗(yàn)的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中進(jìn)行描述，包括試驗(yàn)地點(diǎn)，采用的試劑名稱、規(guī)格和批號，儀器名稱和型號，樣本的背景信息（來源、樣本編號、樣本類型、采集及處理方式、基因型和濃度確認(rèn)方法及結(jié)果）等。分析性能評估用樣本應(yīng)為真實(shí)樣本，如聲稱多種適用樣本類型，注冊申請人應(yīng)針對不同樣本類型分別完成性能評估研究。

分析性能評估的試驗(yàn)方法可以參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評估的指導(dǎo)原則進(jìn)行，對于本類產(chǎn)品建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

2.1樣本穩(wěn)定性及適用的樣本類型

應(yīng)充分考慮樣本采集/處理、運(yùn)輸、保存等各環(huán)節(jié)的影響，確定樣本的保存條件及保存時(shí)間并對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行充分驗(yàn)證。如樣本提取后不立即進(jìn)行檢測，則還需對提取后的DNA穩(wěn)定性進(jìn)行充分研究。如聲稱多種適用樣本類型，注冊申請人應(yīng)針對不同樣本類型分別進(jìn)行樣本穩(wěn)定性研究。

對于全血樣本，如適用多種抗凝劑，建議通過同源比對研究對一定數(shù)量的臨床樣本驗(yàn)證各種抗凝劑的適用性。

2.2質(zhì)控品的賦值

描述質(zhì)控品的賦值過程，并提交三批產(chǎn)品在不同適用機(jī)型上的賦值研究資料。

2.3準(zhǔn)確度

可通過申報(bào)產(chǎn)品與測序結(jié)果或已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行方法學(xué)比對研究，評價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的準(zhǔn)確度；也可通過檢測參考品（盤）分析申報(bào)產(chǎn)品檢測結(jié)果與經(jīng)確認(rèn)結(jié)果的符合情況，評價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的準(zhǔn)確度。

評價(jià)準(zhǔn)確度的樣本應(yīng)由若干份臨床樣本組成，樣本類型應(yīng)與產(chǎn)品適用范圍一致，包含不同濃度水平。

2.4精密度

包括重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性。

精密度評價(jià)應(yīng)采用真實(shí)樣本進(jìn)行研究，納入陰性樣本、弱陽（檢出限附近）樣本和強(qiáng)陽樣本。試驗(yàn)操作應(yīng)按照說明書執(zhí)行，需包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。

精密度評價(jià)需滿足如下要求：

2.4.1對可能影響檢測精密度的主要因素進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括儀器、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、檢測輪次、試劑批次等。

2.4.2設(shè)定合理的精密度評價(jià)周期，并對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、不同操作者間和不同實(shí)驗(yàn)室間的精密度進(jìn)行綜合評價(jià)。

2.4.3可結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn)，對精密度指標(biāo)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如CV值。

2.5最低檢出限和檢測上限

2.5.1最低檢出限和檢測上限的建立

最低檢出限為在滿足檢測準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)基因的人基因組DNA最低濃度。
       可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測，確定95%檢出率水平下的人基因組DNA最低濃度，即為最低檢出限。系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可根據(jù)各濃度梯度檢測結(jié)果直接判定，也可通過適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和其他分析方法計(jì)算申報(bào)產(chǎn)品在設(shè)定概率下的檢出限，一般在該檢測濃度下應(yīng)具有95%的檢出率。

同時(shí)，申請人亦應(yīng)評價(jià)可準(zhǔn)確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當(dāng)檢出率水平下的人基因組DNA最高濃度。

應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行檢出限及檢測上限研究。

2.5.2最低檢出限和檢測上限的驗(yàn)證

選取與建立不同的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，建議對最低檢出限和檢測上限附近濃度水平的樣本進(jìn)行至少20次的重復(fù)檢測，應(yīng)滿足95%以上檢出率要求。

2.6 分析特異性

2.6.1干擾試驗(yàn)

可通過在臨床樣本中添加干擾物質(zhì)的方式，評價(jià)添加前后干擾物質(zhì)對靶基因檢測的影響。研究用樣本應(yīng)包含陰性樣本、弱陽性樣本和中陽性樣本（正常白細(xì)胞濃度水平樣本）。

建議注冊申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評價(jià)，如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

應(yīng)針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。對于全血樣本，內(nèi)源性干擾物質(zhì)應(yīng)包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、白蛋白、；外源性干擾物質(zhì)應(yīng)包括抗凝劑、乙醇、乙醛、預(yù)期人群常用治療藥物等如消炎痛、潑尼松、吡羅昔康、美洛昔康、 塞來昔布、 雙氯芬酸鈉、 吲哚美辛、 萘丁美酮、 布洛芬、 萘普生、柳氮磺胺吡啶等。

同時(shí)納入有代表性的患者樣本，通過對申報(bào)產(chǎn)品與不受該干擾物影響的測量方法檢測結(jié)果進(jìn)行對比，進(jìn)行干擾物質(zhì)研究。

2.6.2交叉反應(yīng)

應(yīng)對與靶基因序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的其他HLA基因的基因序列進(jìn)行交叉反應(yīng)研究。

對于全血樣本，需提供血源性感染常見的病原體（如：乙肝、丙肝、HIV、梅毒）的交叉反應(yīng)研究。

2.7 其他性能研究

2.7.1如申報(bào)產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為具體基因亞型且不能分型，分析性能研究中應(yīng)對申報(bào)產(chǎn)品聲稱的每種基因亞型進(jìn)行研究和驗(yàn)證。

2.7.2包容性研究

如申報(bào)產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為HLA-B27基因，應(yīng)證明申報(bào)試劑具有檢出不同HLA-B27亞型的能力。應(yīng)至少包括中國人群已知常見亞型B2702、B2704、B2705、B2707等。

包容性研究應(yīng)分別對上述常見亞型進(jìn)行精密度（重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性精密度）研究和最低檢出限的驗(yàn)證。

2.8核酸提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。

若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行精密度、檢出限和抗干擾的驗(yàn)證。

2.9反應(yīng)體系研究

2.9.1樣本采集和處理

請?jiān)斒鰳颖镜牟杉疤幚矸绞?，明確樣本的保存介質(zhì)。

2.9.2反應(yīng)體系

應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性，提供反應(yīng)體系的確定研究資料。包括但不限于核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR反應(yīng)中樣本和試劑的加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)條件（如：溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)）等。

如有多個(gè)適用機(jī)型，需提供不同適用機(jī)型基線和閾值的確定資料。不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

3.穩(wěn)定性研究

申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、結(jié)果以及結(jié)論。

3.1實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究

提交至少三批申報(bào)產(chǎn)品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。明確儲存的環(huán)境條件（如溫度、濕度和光照）及有效期。

3.2使用穩(wěn)定性

提交申報(bào)產(chǎn)品實(shí)際使用期間穩(wěn)定性的研究資料，應(yīng)包括所有組成成分的開封穩(wěn)定性。適用時(shí)提交復(fù)溶穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性及凍融次數(shù)研究資料等。明確產(chǎn)品使用的溫度、濕度條件等。

3.3運(yùn)輸穩(wěn)定性

以文字結(jié)合圖示的方式詳細(xì)描述運(yùn)輸包裝，明確產(chǎn)品實(shí)際運(yùn)輸?shù)沫h(huán)境條件（如溫度、濕度、光照和機(jī)械保護(hù)等）及暴露的最差運(yùn)輸條件。提交申報(bào)產(chǎn)品可在特定或者預(yù)期的條件下運(yùn)輸?shù)难芯抠Y料。

4.陽性判斷值研究

陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測準(zhǔn)確性的臨界值（Cut-off）。研究樣本應(yīng)為預(yù)期使用人群的真實(shí)樣本，涵蓋中國人群常見HLA-B27亞型。樣本來源應(yīng)具有地域和民族多樣性，考慮不同時(shí)間和生理/病理狀。

采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進(jìn)行研究，亦可采用其他科學(xué)合理的方法進(jìn)行陽性判斷值研究。

申請人應(yīng)詳述試驗(yàn)方案，列明所用試劑、儀器、對比方法、樣本量、樣本入組標(biāo)準(zhǔn)；提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括民族、性別、年齡、來源、唯一可溯源編號、臨床診斷信息等）及試驗(yàn)結(jié)果等。

如果試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說明灰區(qū)范圍的確定方法。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇、來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供詳細(xì)的制備過程及支持性資料；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗(yàn)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

5.1.1引物和探針

應(yīng)詳述引物、探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物探針序列、靶基因序列及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物探針以供篩選，針對待測位點(diǎn)的檢測靈敏度和特異性等進(jìn)行評價(jià)，選擇最佳引物探針組合，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。同時(shí)應(yīng)針對引物、探針及檢測靶序列與公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，如有同源序列應(yīng)著重評價(jià)是否會有交叉反應(yīng)。

申請人應(yīng)針對選定的引物、探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，一般包括：外觀、分子量、純度、濃度、探針熒光標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以及功能性試驗(yàn)等，并依據(jù)評價(jià)結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對其純度、濃度、保存穩(wěn)定性以及功能性試驗(yàn)等資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.3酶

可能涉及到的酶包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、熱穩(wěn)定性、功能性試驗(yàn)等進(jìn)行評價(jià)和驗(yàn)證，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

5.1.4質(zhì)控品

選擇檢測范圍內(nèi)一種或多種亞型制備陽性質(zhì)控品，同時(shí)設(shè)置不含待測靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控。

HLA-B基因存在個(gè)體差異，并非所有人體均具有HLA-B27，因此試劑盒中需另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)對照。

質(zhì)控體系應(yīng)能夠?qū)z測全過程進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽性結(jié)果。質(zhì)控品可采用臨床樣本核酸提取液或細(xì)胞系等?？瞻踪|(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請人應(yīng)針對質(zhì)控品原料來源、選擇、制備、定值過程等提供詳細(xì)的研究資料，并對質(zhì)控品的檢測結(jié)果做出明確的范圍要求。

5.1.5  內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

5.1.6核酸提取/純化試劑（如有）

應(yīng)提供試劑的主要組成、原理介紹及相關(guān)的篩選及驗(yàn)證資料。

5.1.7企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。企業(yè)參考品應(yīng)為真實(shí)樣本，且應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)和性能驗(yàn)證的實(shí)際需要進(jìn)行設(shè)置。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、濃度及基因亞型確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)研究資料。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品應(yīng)包含可檢出的各HLA-B27亞型，且應(yīng)設(shè)置不同濃度水平。

陰性參考品應(yīng)考慮檢測特異性的評價(jià)，納入同源序列交叉反應(yīng)樣本、干擾樣本、HLA-B27陰性樣本等。

檢出限參考品的設(shè)置與陽性參考品相同，濃度水平應(yīng)包括最低檢出限濃度或略高于最低檢出限濃度。

精密度參考品至少包括HLA-B2704和HLA-B2705；每個(gè)亞型包括高、低兩個(gè)濃度水平，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

該類產(chǎn)品生產(chǎn)工藝研究資料主要包括工作液配制（引物探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干、熒光標(biāo)記等工藝過程的描述及確定依據(jù)。

生產(chǎn)過程應(yīng)對關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制，可結(jié)合工藝流程圖描述生產(chǎn)工藝過程，明確關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。并提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價(jià)資料

臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第72號）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)

應(yīng)選擇至少3家（含3家）已備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)的要求開展臨床試驗(yàn)。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉臨床試驗(yàn)方案。

2.臨床試驗(yàn)方法

如申報(bào)產(chǎn)品已有同類產(chǎn)品上市，建議申請人選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑/方法，采用申報(bào)產(chǎn)品與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，評價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的臨床性能。對比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測性能等方面，確認(rèn)其與申報(bào)產(chǎn)品具有較好的可比性。如對比試劑不可分型，還應(yīng)選擇臨床參考方法（如：一代測序）對臨床試驗(yàn)中的陽性樣本進(jìn)行分型，確認(rèn)申報(bào)產(chǎn)品所聲稱的基因亞型均被驗(yàn)證。

3.受試者選擇和樣本類型

3.1受試者選擇

受試者應(yīng)為強(qiáng)直性脊柱炎疑似患者，應(yīng)具有相關(guān)疑似癥狀或體征等，如：炎性腰背痛、外周關(guān)節(jié)炎和足趾炎等；臨床試驗(yàn)還應(yīng)納入部分需要鑒別診斷的其他患者，如：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者等癥狀相似人群。

3.2 樣本類型

適用的樣本類型一般為靜脈全血。臨床試驗(yàn)應(yīng)納入臨床原始樣本，不應(yīng)直接采用提取的基因組DNA進(jìn)行試驗(yàn)。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)同時(shí)滿足申報(bào)產(chǎn)品說明書以及對比試劑說明書（如適用）的相關(guān)要求。

4.臨床試驗(yàn)樣本量

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算，同時(shí)應(yīng)滿足法規(guī)最低樣本量的要求。

建議采用單組目標(biāo)值法進(jìn)行樣本量估算。陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議均不低于95%。當(dāng)評價(jià)指標(biāo)PT接近100%時(shí)，該樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

上述公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為申報(bào)產(chǎn)品評價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。

臨床試驗(yàn)總體樣本量確定時(shí)應(yīng)在上述陽、陰性樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本等情況適當(dāng)增加入組樣本量.

如申報(bào)產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為具體基因亞型且不能分型，臨床試驗(yàn)應(yīng)對申報(bào)產(chǎn)品聲稱的每種基因亞型進(jìn)行驗(yàn)證，每種基因亞型均應(yīng)有一定的陽性例數(shù)。

如申報(bào)產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為HLA-B27基因，臨床試驗(yàn)至少應(yīng)對常見基因亞型進(jìn)行驗(yàn)證，至少應(yīng)驗(yàn)證HLA-2704、HLA-2705、HLA-2702和HLA-2707等,每種基因亞型均應(yīng)具有一定的陽性例數(shù)。

 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)對入組人群進(jìn)行人口學(xué)分析，包括年齡、性別和臨床診斷背景信息等。應(yīng)總結(jié)各基因亞型的例數(shù)，以2×2表分別總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，并分別計(jì)算陽性符合率、陰性符合率和總符合率及其95%置信區(qū)間。對于可分型的試劑，應(yīng)以2×2表分別總結(jié)兩種試劑不同基因亞型的定性檢測結(jié)果，并分別計(jì)算不同基因亞型的符合率和總符合率及其95%置信區(qū)間。

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用合理方法進(jìn)行復(fù)核，并對差異原因進(jìn)行分析。如無需復(fù)核，應(yīng)說明理由。

6.倫理學(xué)要求

臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對受試者的風(fēng)險(xiǎn)，提請倫理委員會審查，并獲得倫理委員會的同意。注冊申報(bào)時(shí)應(yīng)提交倫理委員會的審查意見。

7.臨床試驗(yàn)方案

各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

試驗(yàn)方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程和結(jié)果判定時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對比試劑/方法應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

8.質(zhì)量控制

臨床試驗(yàn)開始前，建議進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

9.臨床試驗(yàn)報(bào)告撰寫

臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫參考《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（五）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書的技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)注明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

以下內(nèi)容僅對HLA-B27基因檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，說明書其他內(nèi)容應(yīng)根據(jù)《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》要求進(jìn)行編寫。

1.【預(yù)期用途】 應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人體靜脈外周血樣本中的HLA-B27基因。

1.2介紹被測基因與臨床適用癥的關(guān)系，明確HLA-B27在中國人群中的分布頻率，在臨床適用癥人群中的發(fā)生頻率。

1.3明確本產(chǎn)品檢測結(jié)果僅供臨床參考，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、療效及其他實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)等對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

2.【檢驗(yàn)原理】

2.1對被測靶基因在HLA-B基因中的區(qū)域位置，片段大小、保守與否等進(jìn)行詳細(xì)描述，對試劑盒所用探針、引物、陽性結(jié)果的判定方式等進(jìn)行詳細(xì)的介紹；明確內(nèi)標(biāo)基因的名稱及其作用。對不同樣本反應(yīng)管組合、質(zhì)控品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進(jìn)行介紹。

2.2如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機(jī)理進(jìn)行簡要介紹。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分的名稱、數(shù)量和裝量。

明確各組分中的引物、探針、酶、dNTP、緩沖液名稱、防腐劑名稱。

明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱、注冊人，貨號及注冊證號。

明確不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

4.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說明試驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

4.1試驗(yàn)條件：必要時(shí)，應(yīng)明確實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、試驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。

4.2試劑配制方法和注意事項(xiàng)。

4.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)，列明全血樣本用量、洗脫體積等；對核酸提取純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理的質(zhì)量控制，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

4.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

4.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。

4.6儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、各熒光通道選擇等。

5.【陽性判斷值】

明確靶基因和內(nèi)標(biāo)基因的陽性判斷值，簡要說明建立和驗(yàn)證陽性判斷值的基本信息，包括樣本量、人群特征（民族、性別、年齡、生理/病理狀態(tài)等）和采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。

6.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。

7.【檢驗(yàn)方法的局限性】

7.1列明可檢測的HLA-B27亞型，明確其他亞型未進(jìn)行驗(yàn)證。

7.2明確可能出現(xiàn)的交叉反應(yīng)。列明可檢出的同源序列、其他HLA基因等。

7.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析。

7.3.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理或核酸過度降解均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

7.3.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

7.4 明確是否可區(qū)分HLA-B27雜合或純合。

7.5明確正常人群中也可表達(dá)HLA-B27，臨床使用中應(yīng)結(jié)合檢測結(jié)果、其他癥狀/體征、病史、實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

8.1符合國家標(biāo)準(zhǔn)品的情況。

8.2準(zhǔn)確度研究方案和結(jié)果。

8.3精密度研究的總結(jié)，包括實(shí)驗(yàn)方案、樣本量、各樣濃度水平、不精密度考慮因素（時(shí)間、地點(diǎn)和人員等）。

8.4最低檢出限。明確可檢出DNA濃度水平范圍。

8.5干擾研究結(jié)果。明確各內(nèi)源和外源性干擾物對檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響的最高濃度。

8.6交叉反應(yīng)研究結(jié)果。明確納入研究的同源序列/HLA基因是否存在交叉反應(yīng)。

8.7 包容性研究總結(jié)。明確可檢出的亞型。

8.8臨床試驗(yàn)總結(jié)。

9.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

9.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

9.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

（六）質(zhì)量管理體系文件

申請人應(yīng)當(dāng)在申請注冊時(shí)提交與產(chǎn)品研制、生產(chǎn)有關(guān)的質(zhì)量管理體系相關(guān)資料。詳述產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，提供生產(chǎn)工藝流程圖。明確申報(bào)產(chǎn)品反應(yīng)及檢測原理和過程，標(biāo)明主要控制點(diǎn)與項(xiàng)目及主要原材料、采購件的來源及質(zhì)量控制方法。

如適用，應(yīng)當(dāng)提供擬核查產(chǎn)品與既往已通過核查產(chǎn)品在生產(chǎn)條件、生產(chǎn)工藝等方面的對比說明。